Мезофільні аеробні та факультативно анаеробні мікроорганізми кмафанм. Показник кмафанм – як критерій якості продукції

Молоко та молочні продукти є цінними продуктамихарчування тваринного походження. Однак слід пам'ятати, що молоко, отримане від хворих тварин, може бути джерелом зараження людини зооантропонозними (загальними для людини та тварин) хворобами, крім того, при порушенні санітарних правил та технології отримання, переробки та зберігання молоко може стати причиною харчових токсикозів і токсикоінфекцій. .

Джерело первинного обсіменіння молочних продуктів мікроорганізмами – це молоко – сировина. Мікроби проникають у молоко із зовнішнього середовища через вивідні протоки, молочну цистерну та сосковий канал. Неспецифічну мікрофлорумолока складають бактерії, дріжджі, цвілеві гриби. Обсіменіння молока мікроорганізмами відбувається вже в процесі доїння та інтенсивність його залежить від рівня гігієни на фермі, якості миття та дезінфекції доїльного обладнання. У великій кількості мікроби містяться на поверхні шкірного покривутварини. Мікроби на поверхню шкіри потрапляють із корму, підстилки, гною, повітря.

Погані умови зберігання молока також сприяють наростанню в ньому мікрофлори. Свіжовидоїне, парне молоко має бактерицидність, тобто. здатністю затримувати розмноження бактерій, що потрапляють у молоко, і навіть вбивати їх. Щоб зберегти бактерицидні властивості парного молока, його охолоджують. При температурі +30 ° С бактерицидність зберігається протягом 3-х годин, при +15 ° С - близько 8 годин, при +10 ° С - близько 24 годин. Молоко охолоджують відразу після доїння, і до відправлення його зберігають при температурі від +2 до +6°С. У процесі зберігання зникають антимікробні властивості молока, і за недотримання правил зберігання у ньому створюються умови у розвиток небажаної мікрофлори, у результаті продукт псується.

Патогенні мікроорганізми можуть потрапляти в молоко в процесі його отримання та транспортування з довкілляабо можуть утримуватися у молоці хворих тварин. Особливо багато різних мікробів знаходиться в молоці тварин, хворих на мастит (стафілококи, стрептококи та ін). Мікроорганізми можуть потрапляти в молоко через повітря та при контакті хворих тварин туберкульозом, сальмонельозом тощо. І тому, поряд з білком, жиром і кислотністю, бакобсеменённость (або КМАФАнМ) - один із найважливіших показників якості та безпеки молока.

Хороше молоко має відповідно низьку бакобсеменённость. Однак треба пам'ятати, що сире молоко не може мати нульову бакобнасінність. Молоко - живий продукт, отриманий від тварин, а бактерії - невід'ємні супутники будь-якого живого організму, і, як наслідок продуктів його життєдіяльності. Молоко, що містить велика кількістьбактерій, навіть непатогенних і не змінюють органолептичні показники, Не можна вважати повноцінним. Підвищена бактеріальна обсіменіння продукту свідчить про розмноження мікроорганізмів, серед яких можуть виявитися патогенні, що викликають псування продукту. Високий змістмікроорганізмів також може викликати харчове отруєнняз ознаками діареї та гастроентериту.

Вимоги до молока сирого за бактеріальною обсімененістю встановлено нормативними документами РФ, та Технічними регламентами Митного союзу. Бакобнасінність молока - кількісний вміст бактерій в 1 см³ сирого молока. Мікробіологічні показники молока за ЗМЧ (загальне мікробне число) або КМАФАнМ (кількість мезофільних аеробних та факультативно анаеробних мікроорганізмів) повинні відповідати вимогам Технічного регламентуМитного союзу «Про безпеку молока та молочної продукції» (ТР ТС 033/2013) від 09.10.2013 та складати не більше 5,0×10 5 (500000) КУО/см³.

Бактеріальну обсімененість молока, що заготовляється, визначають за допомогою редуктазної проби. Метод заснований на тому, що фермент редуктазу, що виділяється мікрофлорою молока, знебарвлює метиленовий синій барвник. Встановлено зв'язок між кількістю мікрофлори та швидкістю знебарвлення молока, до якого додано метиленовий синій. Чим вища швидкість знебарвлення, тим Велика кількістьмікроорганізмів знаходиться в молоці і, отже, гірша за його якість.

У випробувальних лабораторіях згідно з ГОСТ 32901-2014 «Молоко та молочна продукція. Методи мікробіологічного аналізу», для визначення бактеріальної обсіменіння молока сирого в якості арбітражного методу використовується стандартний чашковий метод посіву певних розведень вихідного молока на тверде живильне середовище з подальшим культивуванням протягом 72 год при 30±1°С і підрахунком колоній утворюючих одиниць (КОЕ) мезофільних -Анаеробних мікроорганізмів (КМАФАнМ)

Таким чином, визначення КМАФАнМ у молоці свідчить про санітарно-гігієнічний стан продукту, ступінь його обсіменіння мікрофлорою, дозволяє судити про стан здоров'я тварини, стан вимені, про ефективність миття та дезінфекції обладнання, про дотримання санітарно-гігієнічних умов виробництва та правил особистої гігієни працівників, про умови зберігання, транспортування готової продукції. Тому цей показник нормується всім молочних продуктів крім продуктів, вироблюваних з допомогою технічно корисної мікрофлори (мікрофлори заквасок).

Соматичні клітини є постійними складовими елементамимолока і представлені: епітеліальними клітинами слизової оболонки молочних залоз, альвеол і дрібних молочних ходів, що являють собою великі округлі клітини (розміром від 12 до 100 мкм і більше) зазвичай у вигляді груп або пластів, рідше у вигляді одиничних клітин; дегенерованими епітеліальними клітинами невизначеної форми зруйнованої структури; форменими елементами крові: лейкоцитами (переважно лімфоцитами, нейтрофілами, еозинофілами та ін.) та еритроцитами. Відомо, що соматичні клітини у видоєному молоці не розмножуються (на відміну бактерій).

Морфолого-цитологічний склад та кількісний вміст соматичних клітин у молоці кожної тварини сильно варіює залежно від різних факторів: віку тварини (у молоці першотел соматичних клітин менше, ніж у корів з великим числом лактацій), періоду лактації (у молоці здорової корови мінімальна кількістьсоматичних клітин спостерігається на 2 – 6 міс. лактації, а підвищене - у молозивний період, наприкінці лактації та в період запуску), породи та індивідуальних особливостей тварини, а також стану здоров'я тварин (особливо від стану вимені), рівня та режимів годівлі та ін.

Зміст соматичних клітин є важливим показником безпеки молока та показує його придатність для переробки. Присутність у молоці великої кількості соматичних клітин веде до серйозного зниження його якісних показників: втрачається біологічна повноцінність, погіршуються технологічні властивості під час переробки. Крім того, знижується кислотність молока, спостерігаються втрати жиру, казеїну, лактози. Молоко стає менш термостійким, гірше згортається сичужним ферментом, уповільнюється розвиток корисних молочнокислих бактерій. З такого молока неможливо виготовити якісні продукти(Сир, сир, йогурт, кефір та ін.). Соматичні клітини впливають як на якість молока, а й у продуктивність корів.

З 1 липня 2017 року вміст у сирому молоці соматичних клітин має бути не більше 7,5×10 5 в 1 см3, при цьому для молока сирого, призначеного для виробництва дитячого харчування, сирів та стерилізованого молока, - не більше 5×10 5 клітин на 1 см3.

Дуже важливо, що вміст соматичних клітин у молоці можна легко та швидко визначити. Для виявлення в сировині, що заготовляється домішки маститного молока використовуються прямі і непрямі методи, засновані на встановленні кількості соматичних клітин. До непрямих методів визначення кількості соматичних клітин у молоці відносяться методи їх виявлення при взаємодії із низкою реагентів. Наразі визначення кількості соматичних клітин у молоці регламентується ГОСТ 23453-2014 «Молоко сире. Методи визначення соматичних клітин» і проводиться з використанням діагностичних препаратів типу «Мастоприм» візуальним способом та із застосуванням віскозиметра. Стандарт розроблено ДНУ «ВНДІМС Россільгоспакадемії».

Метод заснований на дії сульфанолу (поверхнево-активної речовини, що входить до складу препарату "Мастоприм") на клітинну оболонку соматичних клітин, що призводить до порушення її цілісності та виходу вмісту клітин у зовнішнє середовище. У цьому змінюється в'язкість (консистенція), що фіксується візуально чи віскозиметром. Для аналізу використовуються пластинки ПМК-1 з наступною візуальною оцінкою або віскозиметри капілярного типу, відкалібровані виробником приладу визначення кількості соматичних клітин в сирому молоці.

Візуальна оцінка вкрай проста, проте не дає змоги отримати конкретні цифрові показники кількості соматичних клітин у молоці. При візуальній оцінці ми можемо визначити лише межі безпеки згідно з інструкцією реагенту.

У нашій лабораторії вміст соматичних клітин у молоці визначається із застосуванням віскозиметра «Соматос-В.2К». Хід визначення полягає в наступному: 5 мл розчину препарату "Мастоприм" і 10 мл сирого молока, що аналізується, відбирають піпетками і вносять в колбу віскозиметра. Аналізоване сире молоко перед відбором проби необхідно ретельно перемішати і за необхідності очистити від механічних домішок. Суміш аналізованого сирого молока з розчином препарату "Мастоприм" у колбі віскозиметра перемішують протягом (30±10) з у ручному або автоматичному режимі. Після закінчення перемішування визначають кількість соматичних клітин у аналізованому сирому молоці за часом витікання суміші з капіляра. Тривалість витікання визначається в'язкістю суміші сирого молока із розчином препарату "Мастоприм", яка корелює з вихідним вмістом у ньому соматичних клітин. Діапазон визначення кількості соматичних клітин при використанні капілярних віскозиметрів становить від 90 до 1500 тис. 1 см3 сирого молока і тривалість витікання суміші з капіляра коливається від 12 до 58 с.

Показання віскозиметра менше 90 тис. в 1 см3 говорить про фальсифікацію сирого молока як хімічними речовинами, так і шляхом впливу температурою:

Додавання в молоко перекису водню, сечовини, соди та інших речовин, що використовуються для фальсифікації тих чи інших показників молока-сировини, призводить до прямо пропорційного зниження значень віскозиметра залежно від їхньої концентрації;

Будь-яке нагрівання молока до температур термізації або пастеризації призводить до збою показань приладу, і віскозиметр показує значення менше 90 тис. клітин на 1 см3 молока незалежно від їхнього справжнього вмісту.

Ці особливості необхідно враховувати під час аналізу отриманих результатів.

Зміст соматичних клітин - найважливіший непрямий показник здоров'я вимені, оскільки при запальному процесі в молоці різко збільшується кількість клітин крові, зокрема лейкоцитів та нейтрофілів. Запальні процесиє причиною розвитку субклінічних маститів. При субклінічних маститах у вимені не виявляються видимі симптоми запалення, проте вміст соматичних клітин у молоці підвищується. Таким чином, зміни в хімічному складімолока часто є доказом наявності того самого маститу. Найбільш часто збудником субклінічного маститу є стрептококи та стафілококи. Субклінічні мастити можуть довго продовжуватися, завдаючи постійної шкоди як здоров'ю вимені, так і господарству (зменшення продуктивності, зниження ціни на молоко), а також можуть переходити до клінічних маститів.

Існують ще й інші фактори, що впливають на вміст соматичних клітин у молоці, наприклад: помилки при доїнні, дефекти доїльного обладнання, недостатня гігієна, похибки утримання, помилки у годівлі тощо.

Насамкінець хочеться представити деякі цифри: з початку цього року ветлабораторіями області досліджено понад 1500 проб сирого коров'ячого молокавід господарств, з них забракувати за показниками "КМАФАнМ" та "Зміст соматичних клітин" довелося лише 7 проб. Це говорить про хорошій якостімолока, що реалізується сільгосптоваровиробниками нашої області.

Для визначення кількості мезофільних бактерій слід вибирати розведення, при сівбі яких на чашках виростає не менше ніж 30 і не більше 300 колоній.

З кожної проби роблять посів глибинним методом на 2 паралельні чашки Петрі з 2 - 3 послідовних розведень у кількості 1,0 мл, використовуючи для цього 2-відсотковий агар, приготований із поживного сухого агару. Контролювати температуру надійніше та простіше, якщо агар розливають невеликими порціями у пробірки (12 – 15 мл). Агар у пробірках швидше розплавляється і охолоджується рівномірно до потрібної температури. Чашки заливають розплавленим та остудженим до 45 град. З агаром відразу після внесення матеріалу. В іншому випадку може спостерігатися нерівномірний розподіл колоній у вигляді окремих скупчень у товщі агару; для більш рівномірного розподілу посівного матеріалуКрім того, вміст чашки перемішують обертальними рухами.

Після застигання агару чашки з посівами поміщають термостат дном вгору, інкубують за рекомендацією ФАО/ВООЗ при 30 град. C протягом 72 годин; за потреби попередній облік виробляють через 48 годин. Кількість колоній підраховується на кожній із засіяних чашок. Рахунок колоній на чашках виробляють за допомогою пристрою для рахунку колоній бактерій або лупи. Для кращої видимості вважають колонії темному тлі (під чашку кладуть темний папір), чашки поміщають дном догори. Кожну колонію відзначають на дні чашки чорнилом або тушшю.

При підрахунку дотримуються таких правил:

а) якщо на чашці виросло невелика кількістьколоній, приблизно 100, підраховують усі колонії;

Б) якщо колонії розподілені рівномірно та їх кількість вимірюється кількома сотнями (200 – 300 колоній), допускається підрахунок колоній не менше ніж на 1/3 площі чашки. У цих випадках дно чашки ділять олівцем на 6 секторів і вважають колонії у 3 секторах. Потім роблять перерахунок на всю площу чашки: обчислюють середню кількість колоній на площі одного сектора та отриману кількість колоній на одному секторі множать на 6;

В) якщо на чашці виростає більше 300 колоній, вони розподілені рівномірно і не можливе повторити аналіз, то, застосовуючи прилад для рахунку колоній бактерій, підраховують 10 полів зору площею по 1 кв. см в різних місцяхчашки. Отримані числа складають та виводять середнє арифметичне. Щоб вирахувати кількість колоній на всій чашці, отримане середнє число 2 множать на площу чашки (R). Зазвичай діаметр чашки дорівнює 8,5 – 10 см, пі = 3,14. Підставивши дані у формулу, отримуємо при діаметрі чашки, що дорівнює 10 см, площа чашки 78,5 кв. см. За відсутності приладу для рахунку колоній бактерій можна використовувати звичайний міліметровий папір, в якому вирізають віконце площею 1 кв. див. Підрахунок колоній роблять із лупою, як зазначено вище.

приклад. Якщо середня кількість колоній на 1 кв. см становить 18, діаметр чашки 10 см, число колоній на всій площі чашки 18 x 78,5 = 1413, округляючи у відповіді, вказують 1400.

Число колоній, що виросли на чашці, має відображати кількість життєздатних мікроорганізмів, що містяться в засіяному обсязі досліджуваного матеріалу. Оскільки останній, як правило, засівають у розведеному вигляді, число колоній, що виросли на чашці, множать на ступінь взятого розведення, розраховують середнє арифметичне і встановлюють кількість мезофільних аеробних і факультативно анаеробних мікроорганізмів в 1 г (мл) продукту.

При встановленні кількості мезофільних бактерій не всі чашки можуть бути використані для обчислення середнього арифметичного:

А) не можна використовувати посіви для обчислення середнього арифметичного, якщо кількість колоній, що виросли на чашках менше 30. У цьому випадку в протокол досліджень вносять показники обсіменіння, отримані при підрахунку колоній тільки по одній або двох чашках, число колоній на яких більше 30. У разі зростання колоній на засіяних чашках у кількості менше 30 у результатах аналізу рекомендується наступне формулювання: "Зростання одиничних колоній при сівбі (вказати кількість засіяного продукту)";

Б) не використовуються посіви для обчислення середнього арифметичного показника на тих чашках, на поверхні яких більш ніж на 1/2 площі відзначається повзуче зростання спороутворюючих мікроорганізмів, останні можуть маскувати зростання інших бактерій. Можливі випадки, коли на чашках із усіх розведень отримано зростання спорових мікроорганізмів та підрахунок ізольованих колоній практично не можливий. У цих випадках у протоколі дослідження слід зазначати: "Зростання спороутворюючих мікроорганізмів".

приклад розрахунку. Якщо на чашках Петрі при посіві 0,1 г продукту зросло в середньому 135 колоній, а при посіві 2-го розведення (0,01 г продукту) - 9 колоній, то в результатах дослідження враховують цифрові дані, отримані при посіві 1-го розведення , тобто. кількість мікроорганізмів 135 x 10 = 1350 один г продукту.

Для отримання точніших даних щодо кількості мезофільних бактерій доцільно зіставляти результати підрахунку колоній, отримані на чашках з посівами матеріалу з послідовних розведень. Числа підрахованих колоній повинні відповідати приблизно кратності взятих розведень. Якщо кількість колоній на чашках з посівами з наступних розведень (1:10, 1:100) майже збігається або мало різниться, то це вказує на недостатнє перемішування посівного матеріалу при приготуванні розведень і перед посівом.

Купуючи в супермаркетах, на ринку та централізованих точках продажу м'ясо, молоко, рибу, консерви, ми хочемо бути впевненими, у тому вони відповідають санітарно-епідеміологічним нормам. Як відбувається контроль за якістю продукції за ГОСТом?

Представники групи БДКП

Виявлення БГКП (бактерій групи кишкової палички) відбувається внаслідок дослідження у лабораторних умовах із застосуванням непрямих методів. Що це за група бактерій і яка їхня морфологія?

Бактерії цього роду включають понад 100 представників, місцем проживання яких є повітря, грунт, кишечник живих організмів. Вони небезпечні для людини тим, що довгий часможуть перебувати у ґрунті, воді та гинуть тільки при температурі 60 0 С при нагріванні протягом 15 хвилин. ГОСТом встановлено норми, у яких показник цієї групи вважається допустимим. При обсімененості бактеріями вище за встановлений показник або за наявності патогенних представників цієї групи можливі харчові отруєння.

До представників БДКП відносять такі види:

• Ешеріхіози. Даний вид має високу стійкість до несприятливих умов і здатний зберігати життєздатність у молоці до 35 днів, на предметах ужитку від 3 до 5 місяців. Потрапляє до організму через воду, їжу, брудні руки. Особливо до нього сприйнятливі маленькі діти та люди з ослабленим імунітетом.
• Клебсієли. Поширені у ґрунті, воді, зерні, в овочах. Виділяються в молоці та питній воді. Є збудниками захворювань верхніх. дихальних шляхів, суглобів та урогенітальних органів.

Норми ДСТУ

Норми ДСТУ поширюються на всі продукти харчування. При санітарної експертизина наявність патогенних мікроорганізмів застосовують непрямі методи, що дозволяють виявити рівень вмісту патогенних мікроорганізмів. Чим вище цей рівень, тим швидше зараження людини інфекційними захворюваннями.

Існує два мікробіологічні показники, за якими проводиться експертиза харчових продуктів.

1. КМАФАнМ - це показник загальної обсіменіння продуктів. Високий відсотокпоказників КМАФАнМ ( різна групамікроорганізмів на поверхні харчових продуктів) говорить про такі порушення:

• поганий термічної обробкипродуктів;
• неправильне зберігання та транспортування;
• відсутність дезінфекції обладнання.

КМАФАнМ визначають у молоці та молочних продуктах, де не застосовуються спеціальні закваски. Для виявлення КМАФАнМ у молоці використовують спеціальні живильні середовища на основі м'ясопептонного агару.

2. Показник БГКП є індикатором забруднення води, ґрунту через виділення людини. У ГОСТах позначається маса виробу та допустимі нормивиявлення БГКП. Щоб визначити кількість бактерій роду кишкової палички, застосовують середовище Кесслера, які впізнання проводять із застосуванням середовища Эндо.

Індекс чистоти питної водихарактеризується коли-титром та коли-індексом. Титр є основним щодо показників чистоти води. За наявності кишкової палички в 1 мл води вона вважається відносно придатною для пиття. Колі-індекс - знаходження кишкової палички в 1 л води. Індекс присутності кишкової палички, згідно з ГОСТом 2874-82, не повинен перевищувати 3. Коли-індекс вище за норму свідчить про забруднення питної води відходами життєдіяльності живих організмів.

Методи виявлення мікроорганізмів у м'ясі

Метод змиву

Для дослідження на наявність КМАФАнМ на м'ясі застосовують метод змивання. Береться шматок м'яса або тушка птиці та поміщається у стерильний пакет. Туди наливають стерильну воду і струшують пакет із вмістом кілька разів. В результаті змивів виходить вихідний матеріал, який надалі застосовують визначення наявності мікроорганізмів. Результатом дослідження є кількість мікроорганізмів на 1 мл змиву. Відповідно до норм із застосуванням методу змиву в м'ясі індекс загальної кількості мікроорганізмів не повинен перевищувати 10 тисяч КУО/р.

Метод висіву

Встановлення БГКП засноване на методі висіву матеріалу в середу Кесслера (лактозосодержащіе середовище). Посіви вирощують протягом 2 діб та після за морфологічними ознаками визначають тип бактерій.

На великих підприємствах з переробки м'яса, молока, риби існують свої лабораторії, де здійснюють контроль за якістю продукції, що визначаються, визначають рівень БГКП і загальне обсіменіння бактеріями. За відсутності можливості перевіряти продукцію безпосередньо у місцях її випуску проби здають інші спеціалізовані лабораторії.

Динамічний розвиток економіки харчової галузінеможливо без підвищення конкурентоспроможності товарів та послуг. Визначальним споживачам є якість продукції. Виробники повинні знати та вивчати вимоги, що пред'являються до якості товарів, що випускаються ними, вміти кількісно та якісно аналізувати та оцінювати їх показники.

У нормативно-технічній документації контрольовані показники якості поділяють на 3 групи: органолептичні, фізико-хімічні та мікробіологічні.

Мікробіологічні методи дослідження встановлюють ступінь обсіменіння продукту мікроорганізмами і дозволяють виявити наступні зміни якості продукту, його псування.

КМАФАнМ (кількість мезофільних аеробних та факультативно анаеробних мікроорганізмів) – найбільш поширений тест на мікробну безпеку. Цей показникзастосовується повсюдно для оцінки якості продуктів, за винятком тих, у виробництві яких використовуються спеціальні мікробні культури (наприклад, пиво, квас, кисломолочні продуктиі т.п.). У складі КМАФАнМ представлені різні таксономічні групи мікроорганізмів – бактерії, дріжджі, цвілеві гриби. Їх загальна чисельність свідчать про санітарно-гігієнічний стан продукту, ступінь його обсіменіння мікрофлорою.

Продукти, що містять велику кількість бактерій, навіть непатогенних та не змінюють їх органолептичні показники, не можна вважати повноцінними. Значний вміст життєздатних бактеріальних клітин у харчових продуктах(за винятком тих, при виробництві яких застосовують закваски) свідчить або про недостатньо ефективну термічну обробку сировини, або про погане миття обладнання, або про незадовільні умови зберігання продукту. Підвищена бактеріальна обсіменіння продукту свідчить також про його можливе псування.

Для споживача показник КМАФАнМ характеризує якість, свіжість та безпеку продуктів харчування. У той же час, оцінка якості продукту лише за цим показником має низку недоліків. По-перше, це лише загальна кількісна оцінка мікроорганізмів, оскільки при дослідженні не враховуються патогенні, умовно патогенні, психрофільні та термофільні мікроорганізми. По-друге, метод неприйнятний для продуктів, що містять технологічну та специфічну мікрофлору.

Показник КМАФАнМ дозволяє оцінювати рівень санітарно-гігієнічних умов соціальної сфери на виробництві, він дозволяє виявляти порушення режимів зберігання та транспортування продукту.

Винахід відноситься до мікробіології, а саме визначення контамінації харчових продуктів. Спосіб включає приготування м'ясо-пептонного агару, розлив його в чашки Петрі, відбір проб з харчових продуктів, приготування суспензії з навішування харчових продуктів, приготування десяткових розведень досліджуваної суспензії і розміщення десяткових розведень досліджуваної суспензії в чашки Петрі, культивування і підрахунок числа колоній x=a n ×10, n – ступінь розведення. Причому для приготування десяткових розведень досліджуваної суспензії використовують 0,6-0,8% розчин м'ясо-пептонного агару, при цьому десяткові розведення досліджуваної суспензії розміщують на мембранні фільтри, що знаходяться на поверхні м'ясо-пептонного агару в чашці Петрі. Спосіб є оригінальним у рішенні, простим у виконанні, інформативним, дає статистично достовірні результати; дозволяє значно скоротити витрати поживних середовищ, стерильного бактеріологічного посуду та часу проведення аналізу; дозволяє дати реальну кількісну оцінку вмісту мікроорганізмів, що дають зливне зростання і утворюють дуже дрібні колонії, а також дозволяє вивчати внутрішньопопуляційні процеси з використанням світлової мікроскопії. 1 іл., 1 табл.

Винахід відноситься до галузі ветеринарно-санітарної експертизи, санітарії та мікробіології, а саме до визначення контамінації харчових продуктів та санітарно-гігієнічного стану об'єктів зовнішнього середовища.

Найбільш близьким є спосіб визначення кількості мікроорганізмів у ковбасних виробахта продукти з м'яса у воді. Відомий спосібвизначення кількості мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів в 1 г продукту полягає в наступному: приготування розчину для розведення та м'ясо-пептонного агару для посіву; проведення аналізу; облік результатів. 1. Недоліком існуючого способує те, що розчин, що використовується натрію хлориду (0,85%-ний) для розведення проб незабуферен і ізотонічний тільки по відношенню до клітин ссавців, а також для проведення аналізів використовується велика кількість поживного середовища, бактеріологічного посуду і витрат робочого часу. Крім того, цей метод не дозволяє дати реальну кількісну оцінку вмісту мікроорганізмів, що дають зливне зростання і утворюють дуже дрібні (росинчасті) колонії (Методи загальної бактеріології. За ред. Ф.Герхарда та ін. М.: «Мир», 1983, с. 442-512).

Завданням винаходу є зниження кількості використовуваного живильного середовища, бактеріологічного посуду та витрат робочого часу шляхом використання фізіологічного розчину напіврідкого МПА замість 0,85%-ного розчину натрію хлориду з наступним висівом краплі розведеної випробуваної суспензії на поверхню мембранного фільтра.

Застосування даного способузасновано на тому, що як фізіологічний розчин для розведення використовується фізіологічний розчин напіврідкого м'ясо-пептонного агару (0,6-0,8%), що складається з 1 дм 3 дистильованої води, 10 г пептону, 5 г натрію хлориду, 0,3 г безводного КН 2 РО 4 0,6 г безводного NaH 2 РО 4 і 0,6-0,8 г агар-агару; рН середовища 7,0-7,2, краплі якого наносяться поверхню мембранних фільтрів.

Використання як розчин для розведення (0,6-0,8% м'ясо-пептонного напіврідкого агару) з наступним висівом краплі розведеної випробовуваної суспензії на мембранний фільтр є оригінальним у рішенні, простим у здійсненні, інформативним, дає статистично достовірні результати; дозволяє значно скоротити витрати поживних середовищ, стерильного бактеріологічного посуду та часу проведення аналізу; дозволяє дати реальну кількісну оцінку вмісту мікроорганізмів, що дають зливне зростання і утворюють дуже дрібні (росинчасті) колонії, а також дозволяє вивчати внутрішньопопуляційні процеси з використанням світлової мікроскопії.

Для проведення аналізу відбирають проби харчових продуктів згідно діючих нормативним документам(ГОСТ 18963-73. Вода питна. Методи санітарно-бактеріологічного аналізу. М., 1986; ГОСТ 9958-81. Вироби ковбасні та продукти з м'яса. М., 1982; ГОСТ 7702.2.1-95. М'ясо птиці, субпродукт пташині. М., 1994).

Для приготування суспензії навішування харчових продуктів поміщають у стерильну колбу (стакан) гомогенізатора і додають 0,85% розчин натрію хлориду в чотирикратній кількості. Гомогенізацію проводять в електричному змішувачі. Спочатку подрібнюють матеріал на шматочки уповільненою швидкістю обертання ножів, потім при 15000-20000 об/хв протягом 2,5 хв. Допускається за відсутності гомогенізатора приготування випробуваної суспензії у стерильній фарфоровій ступці шляхом розтирання 20 г продукту з 2-3 г стерильного піску, поступово приливаючи 80 см стерильного фізіологічного розчину. Для посівів на живильні середовища стерильною градуйованою піпеткою відбирають завись після 15 хв витримки при кімнатній температурі. 1 мл суспензії містить 0,2 г продукту.

М'ясо-пептонний агар розливають у скляні або пластмасові чашки Петрі (діаметром 9 см) та після того, як агар охолоне, на його поверхні стерильним пінцетом розміщують 5-6 мембранних фільтрів. На схемі представлені основні етапи визначення кількості мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів пропонованим способом.

0,6-0,8%-ний фізіологічний розчин напіврідкого МПА розливають по 9 см 3 стерильні пробірки. Потім у 9 см 3 фізіологічному розчині напіврідкого МПА готують десяткові розведення досліджуваної суспензії. Для цього в першу пробірку з 9 см 3 напіврідкого агару вносять 1 см 3 досліджуваної суспензії, з першої пробірки, ретельно перемішавши 1 см 3 досліджуваної суспензії, переносять у другу і т.д. 0,1 мл (1 краплю) розведеної культури наносять на мембранний фільтр, розташований на МПА у чашці. В одну чашку можна помістити по 5-6 крапель агару з різними культурами. Краплі агару з розведеною культурою застигають через 10-15 хв. Після цього чашки Петрі культивують у перевернутому вигляді термостаті при 37°С протягом 48 годин. Для визначення кількості життєздатних бактеріальних клітин проводять підрахунок колоній у краплях агару.

Для визначення кількості мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів кількість колоній, що виросли, множать на ступінь розведення культури за формулою:

де x - кількість мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів,

a - кількість колоній, що виросли,

n – ступінь розведення.

Для кількісної оцінки вмісту мікроорганізмів, що дають зливне зростання і утворюють дуже дрібні (росинчасті) колонії, а також для вивчення внутрішньопопуляційних процесів з використанням світлової мікроскопії, що виросли на мембранних фільтрах колонії фіксують у парах 25% глутарового альдегіду 30-40 хв. Потім мембранний фільтр накладають на поверхню предметного скла і наносять кілька крапель пропиленоксида. Мембранний фільтр стає прозорим і в мікроскоп або лупу можна вважати дуже дрібні (росинчасті) колонії і при необхідності проводити мікрофотозйомку.

Спосіб пояснюється наступних конкретних прикладах здійснення (див таблицю).

Умовні позначення: спосіб 1 - найближчий аналог

спосіб 2 - пропонований

Приклад 1. Визначення кількості мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів у вареній ковбасі. Визначення кількості мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів проводили двома способами: спосіб 1 (прототип) – Для проведення аналізу м'ясо-пептонний агар розливають у скляні або пластмасові чашки Петрі (діаметром 9 см). Відбір проб харчових продуктів проводили згідно з чинними нормативними документами (ГОСТ 9958-81. Вироби ковбасні та продукти з м'яса. М., 1982). Для приготування суспензії навішування харчових продуктів поміщали в стерильну колбу (стакан) гомогенізатора і додавали 0,85% розчин натрію хлориду в чотирикратній кількості. Гомогенізацію проводили в електричному змішувачі. Спочатку подрібнювали матеріал на шматочки уповільненою швидкістю обертання ножів, потім при 15000-20000 об/хв протягом 2,5 хв. Для посівів на живильні середовища стерильною градуйованою піпеткою відбирали завись після 15 хв витримки при кімнатній температурі. 1 мл суспензії містить 0,2 г продукту. Готували 3 розведення досліджуваної суспензії у фізіологічному розчині хлориду натрію: фізіологічний розчин натрію хлориду розливають по 9 см 3 в стерильні пробірки. Потім 9 см 3 фізіологічному розчині натрію хлориду готують десяткові розведення досліджуваної суспензії. Для цього в першу пробірку з 9 см 3 натрію хлориду вносять 1 см 3 досліджуваної суспензії, з першої пробірки, ретельно перемішавши 1 см 3 досліджуваної суспензії, переносять у другу і т.д. і потім із кожного розведення по 0,1 мл наносили в чашку Петрі (всього 3 чашки). Після цього чашки Петрі культивували в перевернутому вигляді термостаті при 37°С протягом 48 годин. Для визначення кількості життєздатних бактеріальних клітин проводили підрахунок колоній у краплях агару. Для визначення кількості мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів кількість колоній, що виросли, множили на ступінь розведення культури за формулою:

де x - кількість мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів,

a - кількість колоній, що виросли,

n - ступінь розведення,

Спосіб 2 (пропонований) включає приготування розчину для розведення (0,6-0,8%-ний фізіологічний розчин напіврідкого МПА 0,6-0,8%-ний фізіологічний розчин напіврідкого МПА) та м'ясо-пептонного агару для посіву; проведення аналізу; облік результатів.

Для проведення аналізу м'ясо-пептонний агар розливають у скляні або пластмасові чашки Петрі (діаметром 9 см), після того, як агар охолоне, на його поверхні стерильним пінцетом розміщують до 6 мембранних фільтрів. Відбір проб харчових продуктів проводили згідно з чинними нормативними документами (ГОСТ 9958-81. Вироби ковбасні та продукти з м'яса. М., 1982). Для приготування суспензії навішування харчових продуктів поміщали в стерильну колбу (стакан) гомогенізатора і додавали 0,85% розчин натрію хлориду в чотирикратній кількості. Гомогенізацію проводили в електричному змішувачі. Спочатку подрібнювали матеріал на шматочки уповільненою швидкістю обертання ножів, потім при 15000-20000 об/хв протягом 2,5 хв. Для посівів на живильні середовища стерильною градуйованою піпеткою відбирали завись після 15 хв витримки при кімнатній температурі. 1 мл суспензії містить 0,2 г продукту. Готували 3 розведення досліджуваної суспензії у фізіологічному розчині МПА: 0,6-0,8%-ний фізіологічний розчин напіврідкого МПА розливають по 9 см 3 стерильні пробірки. Потім 9 см 3 фізіологічного розчину напіврідкого МПА готують десяткові розведення досліджуваної суспензії. Для цього в першу пробірку з 9 см 3 напіврідкого агару вносять 1 см 3 досліджуваної суспензії, з першої пробірки, ретельно перемішавши 1 см 3 досліджуваної суспензії, переносять у другу і т.д. і потім кожного розведення по 0,1 мл наносили на поверхню мембранного фільтра, розташованого на МПА в чашці Петрі. Причому три розведення розміщували в одній чашці Петрі. Після цього чашки Петрі культивували в перевернутому вигляді термостаті при 37°С протягом 48 годин. Для визначення кількості життєздатних бактеріальних клітин проводили підрахунок колоній у краплях агару. Для визначення кількості мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів кількість колоній, що виросли, множили на ступінь розведення культури за формулою:

де x - кількість мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів,

a - кількість колоній, що виросли,

n – ступінь розведення.

Кількість мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів, визначене за способом 1 - (9×10 2) та за способом 2 - (10×10 2), суттєво не відрізнялося.

Приклад 2. Визначення кількості мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів у м'ясі. Визначення кількості мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів проводили двома способами: спосіб 1 (прототип) – Для проведення аналізу м'ясо-пептонний агар розливають у скляні або пластмасові чашки Петрі (діаметром 9 см). Відбір проб харчових продуктів проводили згідно з чинними нормативними документами (ГОСТ 9958-81. Вироби ковбасні та продукти з м'яса. М., 1982). Для приготування суспензії навішування харчових продуктів поміщали в стерильну колбу (стакан) гомогенізатора і додавали 0,85% розчин натрію хлориду в чотирикратній кількості. Гомогенізацію проводили в електричному змішувачі. Спочатку подрібнювали матеріал на шматочки уповільненою швидкістю обертання ножів, потім при 15000-20000 об/хв протягом 2,5 хв. Для посівів на живильні середовища стерильною градуйованою піпеткою відбирали завись після 15 хв витримки при кімнатній температурі. 1 мл суспензії містить 0,2 г продукту. Готували 6 розведень досліджуваної суспензії у фізіологічному розчині натрію хлориду: фізіологічний розчин натрію хлориду розливають по 9 см 3 стерильні пробірки. Потім 9 см 3 фізіологічному розчині натрію хлориду готують десяткові розведення досліджуваної суспензії. Для цього в першу пробірку з 9 см 3 натрію хлориду вносять 1 см 3 досліджуваної суспензії, з першої пробірки, ретельно перемішавши 1 см 3 досліджуваної суспензії, переносять у другу і т.д. і потім із кожного розведення по 0,1 мл наносили в чашку Петрі (всього 6 чашок). Після цього чашки Петрі культивували в перевернутому вигляді термостаті при 37°С протягом 48 годин. Для визначення кількості життєздатних бактеріальних клітин проводили підрахунок колоній у краплях агару. Для визначення кількості мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів кількість колоній, що виросли, множили на ступінь розведення культури за формулою:

де x - кількість мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів,

a - кількість колоній, що виросли,

n – ступінь розведення.

Спосіб 2 (пропонований), що включає приготування розчину для розведення (0,6-0,8%-ний фізіологічний розчин напіврідкого МПА і 0,6-0,8%-ний фізіологічний розчин напіврідкого МПА) та м'ясо-пептонного агару для посіву; проведення аналізу; облік результатів.

Для проведення аналізу м'ясо-пептонний агар розливають у скляні або пластмасові чашки Петрі (діаметром 9 см) і після того, як агар охолоне, на його поверхні стерильним пінцетом розміщують 5-6 мембранних фільтрів. Відбір проб харчових продуктів проводили згідно з чинними нормативними документами (ГОСТ 9958-81. Вироби ковбасні та продукти з м'яса. М., 1982). Для приготування суспензії навішування харчових продуктів поміщали в стерильну колбу (стакан) гомогенізатора і додавали 0,85% розчин натрію хлориду в чотириразовій кількості. Гомогенізацію проводили в електричному змішувачі. Спочатку подрібнювали матеріал на шматочки уповільненою швидкістю обертання ножів, потім при 15000-20000 об/хв протягом 2,5 хв. Для посівів на живильні середовища стерильною градуйованою піпеткою відбирали завись після 15 хв витримки при кімнатній температурі. 1 мл суспензії містить 0,2 г продукту. Готували 6 розведень досліджуваної суспензії у фізіологічному розчині МПА: 0,6-0,8%-ний фізіологічний розчин напіврідкого МПА розливають по 9 см 3 стерильні пробірки. Потім у 9 см 3 фізіологічному розчині напіврідкого МПА готують десяткові розведення досліджуваної суспензії. Для цього в першу пробірку з 9 см 3 напіврідкого агару вносять 1 см 3 досліджуваної суспензії, з першої пробірки, ретельно перемішавши 1 см 3 досліджуваної суспензії, переносять у другу і т.д. і потім кожного розведення по 0,1 мл наносили на поверхню мембранного фільтра, розташованого на МПА в чашці Петрі. Причому 6 розведень розміщували у двох чашках Петрі. Після цього чашки Петрі культивували в перевернутому вигляді термостаті при 37°С протягом 48 годин. Для визначення кількості життєздатних бактеріальних клітин проводили підрахунок колоній у краплях агару. Для визначення кількості мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів кількість колоній, що виросли, множили на ступінь розведення культури за формулою:

де x - кількість мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів,

a - кількість колоній, що виросли,

n – ступінь розведення.

Після культивування в чашках Петрі при 37°С протягом 48 годин кількість мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів, визначене за способом 1 - (8×10 5) і способом 2 - (7×10 5) істотно не відрізнялося.

З наведених прикладів видно, що з порівняльної оцінці двох методів число КУО, визначене за пропонованим способом, істотно не відрізнялося від такого щодо загальноприйнятим методом. У той же час розроблений метод має низку переваг. Так, визначення кількості життєздатних клітин за п'ятьма видами зразків склали: по існуючому - 98 хв; за пропонованим методом - 48 хв. Витрати живильного середовища склали за прототипом - 420 мл; за пропонованим способом - 135 мл. Кількість чашок Петрі становило прототипу - 28 штук; за пропонованим методом – 9 штук.